2017年3月6日

由:douano@www.291q.com

作者:伊莱亚斯博士，资深科学家

什么是内毒素?

内毒素(又名脂多糖，LPS或lipoglycan)是革兰氏阴性细菌外膜的一部分，由脂质部分和多糖部分组成，后者由内芯、外芯和o抗原通过共价键连接而成¹．在动物体内，内毒素的脂质部分(称为脂质A)常引起免疫细胞表面toll样受体4复合物(TLR4/MD2/CD14)介导的强烈免疫应答²．这种免疫反应的不受控制的激活通常与炎症介质的产生有关。这可能导致毛细血管渗漏综合征，引起血管内皮层损伤和扩张，心功能下降，体温升高(发热);通常称为致命的感染性休克^1、2．

为什么内毒素污染在实验室很常见?

由于细菌在自然界中广泛存在，与植物和动物共存，内毒素无处不在。内毒素从死亡的细菌中自然释放，或作为正常细菌生命周期的一部分以囊泡/泡的形式释放^3.．的关键属性之一内毒素是其热稳定性高;发现在正常的消毒条件下很难使其失效/销毁。事实上，蒸汽杀菌在消灭活微生物的同时，无意中增加了玻璃器皿上的内毒素水平⁴．从生物化学角度来看，内毒素本质上是疏水的，它们倾向于粘附在其他疏水材料上，如常见的塑料实验室器皿上。由于这些特性，内毒素污染在实验室程序中很常见。美国和欧洲药典指南规定，完全破坏内毒素需要在250℃干燥灭菌30分钟⁵．

FDA对内毒素浓度的限制是什么?

人类被发现对内毒素比其他动物敏感得多。虽然每公斤体重1微克的内毒素剂量会导致人类感染性休克，但小鼠可以耐受1000倍以上的剂量。由于细菌内毒素是最常见的热原污染物，美国食品和药物管理局(FDA)对人类和兽医非肠道药物和医疗器械的内毒素浓度设置了限制。内毒素水平以EU/ml计算，其中EU代表内毒素单位。根据所使用的参考标准，一欧罗巴约等于0.1至0.2纳克内毒素/毫升溶液;这是10的内毒素含量⁵到10¹⁰细菌。FDA指南规定，应使用内毒素单位而不是重量进行测试比较，因为内毒素引起热原效应的效力取决于多种因素:多糖链长度、聚集、在生物液体中的溶解度、细菌来源、相关物质等。目前美国药典(USP)对肠外给药的内毒素限值为每小时5欧盟/千克体重，鞘内给药为0.2欧盟/千克。医疗器械的内毒素限值为0.5欧/ml或20欧/器械，而与脑脊液接触的器械内毒素限值为0.06欧/ml或2.15欧/器械伟德亚洲游戏室^{6 - 9}．

什么是兔子热原测试?

在20世纪40年代引入的兔子热原测试，在筛选用于验证肠外药物的水和溶液方面非常成功。然而，这种测试是昂贵的，耗时的，不是很定量。在20世纪70年代体外测定方法是根据观察马蹄蟹(鲎波吕斐摩斯)阿米巴细胞裂解液在内毒素含量很低的情况下会凝结。这被称为鲎试剂(limus Amebocyte Lysate, LAL)。LAL检测在20世纪70年代被FDA批准用于测量与血液接触的肠外药物、设备和产品中的LPS伟德亚洲游戏室⁸．至少有三种形式的LAL化验，每一种都有不同的敏感性:1)LAL凝胶凝块测定，2)LAL动力学浊度测定，和3)LAL显色测定。前者能检测到0.03 EU/ml以下的内毒素，后者能检测到0.01 EU/ml以下的内毒素^7、8．

什么是低内毒素/脂多糖回收率(LER/LLR)?

虽然LAL是一种检测内毒素含量极低的有效方法，但最近发现产品或加工材料中可测量的内毒素浓度随着时间的推移(如在储存期间)而下降，尽管样品在USP热原检测中可能保持热原性，这引起了越来越多的关注。这种现象被称为低内毒素/脂多糖回收率或LER/LLR。研究表明，内毒素被广泛使用的聚山梨酸酯和柠檬酸盐等药物辅料或添加/污染的蛋白质所掩盖可能会发生LER/LLR现象^8、10、11．

由于LER已经在一系列不同的样本矩阵中观察到，LER的具体机制尚未得到解释;尽管已经提出了一些假设。Chen和Vinther认为，螯合剂和聚山梨酯可能会掩盖内毒素，并形成LER/LLR复合物，抑制内毒素与其受体C因子的结合，这是LAL反应所需的¹²．然而，其他研究的结果并不支持任何具体的机制。在一项研究中，在低浓度的表面活性剂(0.0001% v/v聚山梨酸酯20)下，LAL活性增强到约180%。随着表面活性剂浓度的增加，LAL活性下降，在约0.0025% v/v聚山梨酸酯20时降至几乎为零。其他研究表明，内毒素与配方之间在聚集、增溶和掩蔽方面存在相互作用。据报道，时间和温度对LER也有影响。据报道，LER现象在室温下比在2-8℃下发生得更快，7天的孵育足以确定药物是否表现出LER。当有机化合物，如柠檬酸盐，醋酸盐和MES缓冲液，包括苯甲脒(蛋白酶抑制剂)或EDTA或二甲基亚砜作为辅料存在于产品中时，LER也被报道^{12日,13日,17岁}．

目前FDA的建议和指导方针是什么内毒素/脂多糖回收率低?

随着大量研究表明药物配方中的LER/LLR现象越来越明显，FDA开始关注药物和医疗设备中的LER/LLR，并提出了新的USP指南，尽管旧指南已经到位。USP指南建议药品生产商应进行保持时间研究，以检测所有新药的LER/LLR。保存时间的研究应通过在未稀释的产品中加入已知数量的内毒素，然后在适当的存储条件下测量随时间变化的可检测内毒素浓度¹³．内毒素浓度下降表明存在LER。除了保持时间研究之外，USP还提出了一个新的参考标准(RS)，即来自革兰氏阴性细菌的自然发生内毒素(NOE)。USP科学部首席科学联络员Radhakrishna S. Tirumalai博士在最近的综述中详细描述了使用NOE作为RS的原因¹⁴．未来使用NOE进行LPS定量的原因是非常深思熟虑的:首先，天然内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的囊泡或“泡”。其次，由自然死亡细菌产生的细胞壁碎片是现实生活中的污染物，可能存在于制药原料、水系统、工艺样品和最终药品中。第三，化学提取的LPS通常被称为“内毒素”，在自然界中不存在，它在生物化学上与天然内毒素不同。第四，提取的LPS从细胞壁剥离，被吸收到表面，在溶液中形成胶束等聚集体。第五，不同的产品配方和温度、pH、盐、洗涤剂、螯合剂等因素对聚合也有影响。显然，提取的LPS作为RS可能是不合适的选择，因为它在化学上、生物学上和结构上与天然的革兰氏阴性细菌细胞壁碎片不同。新的USP指南还包括对菌株的建议，以及模拟“真实世界”内毒素污染的“NOE”的制备、存储和记录方法¹⁴．

克服低内毒素/低脂多糖恢复的策略是什么?

已经提出了一些克服LER/LLR的策略。样品稀释到1/1000时，添加的内毒素在内毒素测定中克服LER/LLR的回收率显著提高¹⁵．在两种由聚山梨酯80、柠檬酸盐或磷酸钠配制的抗体中添加硫酸镁，在内毒素试验中显示可以减轻LER/LLR^15日16．一项研究报告了冻融制度可以减轻LER/LLR。其他研究表明，蛋白酶处理，以揭开内毒素工作，以减轻内毒素测定中的LER^16、17．考虑到与不同产品和辅料的不同相互作用，可以想象，一种特定的策略不会适用于所有产品，需要为每种产品制定策略^{16日至18日}．

结论:

由于内毒素含量丰富，热稳定性高，难以清除，因此建议采用两种一般策略来解决和减轻LER/LLR现象。第一个策略是最大限度地减少所有层面的内毒素污染，即在进入产品的材料中，在生产过程中涉及的所有过程中，预防生产过程中的生物负担，并确保在相关工艺步骤中去除内毒素。其次，制定策略来测试LER，并制定方法来克服LER/LLR。

列出实验室是高品质内毒素的主要制造商之一。我们的脂多糖(LPS)及其衍生品(产品# 400，# 401，# 421，# 423，# 433，# 434)采用专利技术从各种细菌来源中提纯而成。GMP级内毒素可通过定制订购。这些内毒素广泛应用于免疫生物学领域，作为各种细胞培养工作中的免疫刺激剂/调节剂和佐剂。在细胞培养研究中，无内毒素培养基和试剂被认为是一种常规做法，因为内毒素已被证明会影响/干扰细胞生长和功能，并且已知是显著变异性的来源。我们的每一种毒素产品都由我们的QC部门使用FDA许可的LAL检测试剂盒和FDA批准的LAL检测方法进行仔细测试，以测量内毒素的水平。内毒素含量详见产品分析证书。

1. 里切尔，e.t.，Kirikae, T.， Schade, F.U.， Mamat, U.， Schmidt, G.， Loppnow, H.， Ulmer, a.j.， Zähringer, U.， Seydel, U.， Di Padova, F.;细菌内毒素:结构与活性和功能的分子关系。中华医学工程学报，2004,19(2):366 - 366。PMID:8119492.
2. 大藤，深濑，K，三宅，K，清水，T。结构基础通过先天免疫受体TLR4/MD-2进行物种特异性内毒素感知。《。学会科学。中华人民共和国学报，2012,5月8日;39(4):344 - 344。PMID:22532668．
3. 库尔普，A.，库恩，M.J.生物功能以及分泌的细菌外膜囊泡的生物发生。为基础。中国生物医学工程学报，2010,34(4):344 - 344。PMID:20825345．
4. 海克尔，W .，维特索尔，D.，斯塔克，A.。干热灭活细菌内毒素的验证。PDA J Pharm。科学。科学技术，1994,7- 8;48(4):197-204。PMID:7804819．
5. 醒来时,T。破坏用LAL法和热原法测定典型内毒素的干热含量。我父母。科学。科学通报，1993,9 - 10;47(5):258-64。PMID:8263663．
6. 戈比特，m.b.，塞弗顿，M.V.内毒素:不速之客。2005年12月,26(34):6811 - 7。PMID:16019062.
7. Iwanaga, S。生化原则鲎试验检测细菌内毒素．Proc日本。物理生物学B爵士。科学通报，2007,35(4):344 - 344。PMID:24019589．
8. 陈杰，安德斯六世。常见生物制品中的低内毒素回收率(LER)。肠外药物协会年会，奥兰多，佛罗里达州，2013年4月。
9. 美国食品和药物管理局。工业指南:热原和内毒素检测:问题和答案。2012年6月。
10. 博登，j.s.，沃伯顿，r.e.，费伦，R.，墨菲，M.，史密斯，k.r.，德费利皮斯，m.r.，陈，D.。内毒素使用鲎试剂(LAL)测定恢复。2016年9月,44(5):434 - 40。PMID:27470947．
11. 凯伦Z.M.目前USP对低内毒素回收率(LER)的看法。内毒素检测第四部分。《美国医药评论》2016年增刊。Recovery-LER /。
12. 陈，J.， Vinther, A.。常见生物制品中的低内毒素回收率(“LER”)。奥兰多:肠外药物协会年会;2013.
13. 凯伦，Z.，拉达克里希纳，T.，大卫，H.，詹姆斯，A.，丹尼斯，G.，罗伯特，M.和唐纳德，S.。内毒素标准及其在恢复研究中的作用:前进的道路。亚洲生物制药。2016年11月/ 12月。
14. Radhakrishna, s.t.。自然产生的内毒素:美国药典提出的一种新的参考物质。美国医药评论。内毒素补充剂2016。
15. Burgenson, A.L.不同来源的内毒素:反应性和可恢复性的可变性。在药物微生物学论坛上发表。细菌内毒素峰会，费城，宾夕法尼亚州。2014.
16. Platco C。实验室经验:内毒素回收率低。在药物微生物学论坛上发表。细菌内毒素峰会，费城，宾夕法尼亚州。2014.
17. 威廉姆斯,K.L.内毒素聚集和结合特性。从产品和容器涂层中回收内毒素尖刺。在肠外药物协会会议上的演讲，柏林，德国。2014。
18. 蒂姆,S。制药过程中蛋白质内毒素的去除。内毒素检测第四部分，《美国药学评论》增刊，2016。